摘要
木質纖維素生物質在單一反應器中進行水解和發酵的新型加工策略，為生物商品和生物燃料的生產提供了巨大的潛在成本節約。一個關鍵挑戰是在高產物濃度下保持高酶產量。為實現此目標，我們對纖維素分解、產乙醇的細菌Clostridium phytofermentans進行了適應高乙醇濃度的馴化。獲得的乙醇耐受性（ET）菌株的乙醇耐受性幾乎比野生型提高了一倍，但在低乙醇濃度下乙醇產量和生長速率均有所降低。ET菌株的基因組在涉及膜生物合成、Rnf復合物、陽離子穩態、基因調控和乙醇生產的蛋白質中發生了編碼變化。特別地，對突變型雙功能乙醛輔酶A（CoA）/醇脫氫酶的純化表明，G609D變體使其活性（包括乙醇形成）喪失。在ET菌株中異源表達Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，增加了纖維素消耗并恢復了乙醇產量，證明了如何利用代謝工程來克服在乙醇適應過程中產生的不利突變。我們討論了ET菌株的遺傳變化如何揭示了提高微生物溶劑耐受性的新的潛在策略。
木質纖維素生物質轉化為燃料和商品是大規模、可再生的石油替代方案。這種多步生物轉化傳統上在一系列獨立的工藝中進行，但整合生物加工（CBP）是一種具有潛在經濟優勢的替代范式（1）。在CBP中，酶生產、水解和發酵在單個反應器中發生，從而節省資本和運營成本，并產生協同效應（2）。我們研究了Clostridium phytofermentans，一種有前景的CBP候選菌，它能將植物生物質主要發酵為乙醇（3, 4）。C. phytofermentans水解預處理過的玉米秸稈（包括葡聚糖和木聚糖）的效率，與使用商業酶和木糖發酵酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同時糖化共發酵（SSCF）相似（5）。C. phytofermentans發酵預處理過的玉米秸稈可達到7 g liter-1的乙醇濃度（6），而C. phytofermentans和S. cerevisiae cdt-1的穩定共培養物可將約70 g liter-1的纖維素發酵為22 g liter-1的乙醇（7），該乙醇濃度會抑制C. phytofermentans的生長。因此，應用C. phytofermentans等CBP細菌可能需要提高其溶劑耐受性，同時不損害酶生產或可溶性碳水化合物發酵為乙醇的能力。
大量努力集中在使梭菌適應更高的溶劑水平，并研究與溶劑適應相關的遺傳和生理變化（8-13）。其他研究表明，在主要產生乙醇以外發酵產物的梭菌中，乙醇產量得到提高。表達丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶（ADH）的C. celluloyticum克服了丙酮酸積累，并將發酵產物從乳酸轉變為乙酸和乙醇（14）。在C. thermocellum中，通過丙酮酸激酶（15）重定向碳流、失活乳酸脫氫酶和磷酸轉乙酰酶（16）以及刪除氫化酶（17）均能改善乙醇生產。這些結果表明，盡管基因工具現在才被開發出來，但在纖維素分解梭菌中工程化改進乙醇生產是可能的。然而，開發既耐受乙醇又能高產乙醇的菌株仍然是一個重大挑戰。
本文中，我們試圖通過連續傳代到遞增的乙醇濃度中，開發一株具有提高乙醇耐受性的C. phytofermentans菌株，并表征其生長和發酵特性。我們對ET菌株基因組進行了測序，以揭示適應過程中出現的基因組突變，并通過異源表達替代乙醇形成途徑來克服ET菌株乙醇產量降低的問題。我們討論了本研究的結果如何增進我們對微生物如何適應乙醇等溶劑高濃度的理解。
材料與方法
培養。C. phytofermentans ISDg (ATCC 700394) 在Coy厭氧工作站中，在1.5% H2/98.5% N2氣氛下進行厭氧培養。培養物在30°C、pH調整為7的GS2培養基（18）中靜置培養，并如文中所述補充碳源。生長動力學通過密封的100孔微孔板（Bioscreen 9502550）中的600 nm光密度（OD600）監測，如前所述（19）；每次光密度測量前，對培養物進行短暫搖晃以重懸細胞。用于底物消耗和發酵產物分析的纖維素、纖維二糖和葡萄糖培養物在100-ml血清瓶中生長，脫氣后用丁基橡膠塞密封。
C. phytofermentans乙醇耐受性（ET）菌株通過連續傳代（1:50稀釋）到含有10 ml補充了遞增乙醇濃度的GS2培養基的培養管中進行篩選。從在4%（體積/體積）（31.5 g liter-1）乙醇中的培養物開始，每周傳代到含有相同乙醇濃度和乙醇濃度高1%的新鮮培養基中。如果在較高濃度下1周后未觀察到生長，則培養物重新傳代到相同的乙醇濃度。如果培養物在較高乙醇濃度下生長，則該培養物再次傳代到該乙醇濃度和高1%的乙醇濃度。在7次每周傳代后觀察到在5%乙醇中生長，13次傳代后在6%乙醇中生長，19次傳代后在7%乙醇中生長。每次乙醇耐受性提高時，將細胞鋪板，挑取單個菌落，并重新接種液體培養物，以確保選擇是基于一株具有提高的乙醇耐受性的特定菌株，而不是基于一個共同在提高的乙醇濃度下存活的菌株聯盟。因此，ET菌株是從在補充了7%（體積/體積）乙醇的GS2培養基中生長的母培養物中通過菌落純化分離得到的。經菌落純化后，確認ET菌株具有與母培養物相似的乙醇抗性。
纖維素和發酵分析。培養物中剩余的纖維素水平通過用無菌注射器從10-ml培養管中取1-ml樣品，放入預稱重的1.7-ml微量離心管中，在13,000 x g離心10分鐘進行測量。去除上清液，纖維素沉淀被洗滌并再次在13,000 x g離心10分鐘。沖洗后的沉淀在70°C下干燥直至恒重。細胞生物量對總纖維素重量的貢獻未計入，并假設由于厭氧生物量產量低而最小。
發酵產物濃度在0.22 μm孔徑過濾的培養上清液中使用Agilent 1100高效液相色譜（HPLC）與Jasco RI-1531折射率檢測器（RID）和Aminex HPX-87H陽離子交換柱（Bio-Rad）進行測量。HPLC運行使用0.01 M硫酸流動相，柱溫65°C，RID溫度30°C，樣品體積25 μl，操作流速0.6 ml/min。產物形成相對于接種時培養基中的濃度進行報告。氣相測量通過抽取1 ml頂空并注入100 μl到氣相色譜儀（Model 8610C multiple-gas analyzer; SRI Instruments）中進行。氬氣作為載氣，并調整至30 lb/in2 表壓。使用不銹鋼分子篩（13x）和硅膠填充柱進行樣品分離，組分使用熱導檢測器（TCD）檢測。柱室溫度初始保持在40°C 3.5分鐘，然后程序升溫至160°C 2分鐘，再至300°C 10分鐘，之后讓柱冷卻至40°C直至樣品運行結束。
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