研究簡介
本研究揭示了假單胞菌（Pseudomonas putida S16）中尼古丁降解的未知途徑。尼古丁是一種常見的有機污染物，主要來源于煙草加工廢棄物。假單胞菌能夠利用尼古丁作為碳源和氮源進行生長，但其降解尼古丁的分子機制尚不清楚。
本研究人員通過蛋白質組學和分子遺傳學方法，全面分析了假單胞菌在尼古丁和甘油（非抑制性碳源）培養條件下的蛋白質表達差異，揭示了尼古丁降解的關鍵酶和基因。研究發現，假單胞菌在尼古丁培養條件下表達的蛋白質組包含1292種蛋白質，其中126種蛋白質在尼古丁和甘油培養條件下表達差異顯著。這些差異表達的蛋白質主要涉及運輸、解毒、氨基酸代謝等功能。研究還發現，3-琥珀酰吡啶（SP）轉化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶（HSP）的關鍵步驟由一種多酶反應催化，涉及鉬蝶呤結合氧化酶（spmA）、鉬蝶呤脫氫酶（spmB）和（2Fe-2S）結合鐵氧還蛋白（spmC），并以鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸為輔因子。
此外，研究還克隆并表征了一種新的尼古丁氧化還原酶基因（nicA2）。nicA2與之前已知的nicA1基因（編碼尼古丁氧化還原酶）具有低氨基酸同源性（10.9%）。通過基因敲除實驗，發現刪除nicA2而非nicA1會阻止假單胞菌對尼古丁的降解，表明nicA2在尼古丁降解中起關鍵作用。本研究還構建了多個基因敲除突變株，包括mfs、sapd、pnao和nicA2基因敲除株，進一步證實了這些基因在尼古丁降解中的重要性。
通過蛋白質組學和轉錄組學的結合分析，本研究不僅揭示了尼古丁降解的新途徑，還為環境污染物的生物降解提供了新的靶點。這些發現對于理解假單胞菌如何適應和降解環境中的有毒化合物具有重要意義，并可能為未來的生物修復和生物催化應用提供理論基礎。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于監測和比較不同菌株在特定培養條件下的生長情況。使用了野生型菌株Pseudomonas putida S16和多個基因敲除突變株（如S16dspm、S16dmfs、S16dsapd、S16dpnao和S16dnicA2）。這些菌株在含有尼古丁作為唯一碳源和氮源的培養基中進行培養。通過連續監測培養基中的光密度（OD）變化來記錄菌株的生長曲線。Bioscreen每隔一定時間（如每小時）測量一次培養基的OD值，從而生成詳細的生長曲線。通過Bioscreen C獲得的生長曲線，研究人員能夠直觀地比較野生型菌株和各個基因敲除突變株在尼古丁培養基中的生長差異。
實驗結果
通過蛋白質組學和分子遺傳學方法，系統地揭示了假單胞菌（Pseudomonas putida S16）中尼古丁降解的未知途徑。在尼古丁和甘油培養條件下，假單胞菌S16的蛋白質組包含1292種蛋白質，其中126種蛋白質表達差異顯著。這些差異表達的蛋白質主要涉及運輸、解毒、氨基酸代謝等功能，表明假單胞菌在尼古丁存在時會調整其蛋白質表達以適應環境壓力。研究發現3-琥珀酰吡啶（SP）轉化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶（HSP）的關鍵步驟由一種多酶反應催化，涉及鉬蝶呤結合氧化酶（spmA）、鉬蝶呤脫氫酶（spmB）和（2Fe-2S）結合鐵氧還蛋白（spmC），并以鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸為輔因子。這一發現填補了尼古丁降解途徑中的關鍵空白。克隆并表征了一種新的尼古丁氧化還原酶基因（nicA2），其編碼的酶將尼古丁轉化為N-甲基假膽堿。nicA2與已知的nicA1基因（編碼尼古丁氧化還原酶）具有低氨基酸同源性（10.9%）。通過基因敲除實驗，發現刪除nicA2而非nicA1會阻止假單胞菌對尼古丁的降解，表明nicA2在尼古丁降解中起關鍵作用。構建了多個基因敲除突變株，包括mfs、sapd、pnao和nicA2基因敲除株，進一步證實了這些基因在尼古丁降解中的重要性。
圖1、銅綠假單胞菌S16的吡咯烷途徑尼古丁代謝圖。A.展示了S16中尼古丁分解代謝的完整步驟。
圖2、尼古丁降解相關蛋白的表達水平變化。MS光譜計數檢測到Porin、Mfs、SpmC、SpmA、Sapd、Pnao、NicA2、HspA、HspB和NicA1的表達。紅色表示尼古丁培養基，藍色表示甘油培養基。柱狀圖表示歸一化光譜計數的平均值±標準誤。
圖3、差異表達蛋白的轉錄水平驗證。A.RT-qPCR檢測9個目標基因的mRNA表達水平，使用16S rRNA基因作為內參。結果為三次獨立實驗的均值±標準差。B.半定量RT-PCR驗證目標基因轉錄情況，16S rDNA作為內控。
圖4、spmABC基因的缺失與互補實驗。A.野生型S16與spmABC缺失突變株S16Δspm在尼古丁培養基中的生長曲線。B.HPLC檢測野生型與突變株對尼古丁的降解及SP的積累情況。C.野生型、突變株及攜帶互補質粒pME6032-spm100的菌株在尼古丁培養基中的生長曲線。D.HPLC檢測野生型與不同質粒攜帶株對SP的降解情況。
圖5、野生型S16與基因缺失突變株的生長及靜止態反應。A)在尼古丁平板上生長情況。B)在含卡那霉素的LB平板上生長情況。C)野生型、S16Δpnao、S16ΔnicA2在尼古丁培養基中的生長曲線。D、E)HPLC檢測培養細胞與靜止細胞對尼古丁的降解情況。
總結
銅綠假單胞菌(Pseudomonas putida)菌株是少數能夠利用有毒和外源性化合物（如尼古丁）作為生長底物的微生物之一。雖然早在50多年前人們就發現了假單胞菌的尼古丁降解能力，但其潛在的分子機制一直不清楚。過去幾年中，通過基因組文庫篩選和野生型酶的純化，做出了大量努力來鑒定3-琥珀酰吡啶（SP）羥基化的關鍵基因，但這些嘗試均未能找到與SP羥基化相關的基因。
在本研究中，通過比較遺傳學分析，本研究首次從P.putida S16中鑒定出三個關鍵基因spmA、spmB和spmC。由這些基因編碼的異源三聚體酶需要鉬蝶呤-胞苷二核苷酸（Mo-MCD）作為輔因子。以尼古丁或甘油為唯一碳源培養的S16蛋白質組中共檢測到1292種蛋白質，為闡明尼古丁降解相關酶提供了詳盡的信息。
通過比較尼古丁培養與甘油培養的細胞蛋白質組，研究人員發現了與尼古丁分解代謝相關的多種細胞過程和功能。Bioscreen C在本研究中發揮了關鍵作用，為研究者提供了可靠的生長分析數據，支持了基因功能的驗證和尼古丁降解途徑的解析。本研究不僅揭示了尼古丁降解的新途徑，還為理解假單胞菌如何適應和降解環境中的有毒化合物提供了新的視角。這些發現對于未來的生物修復和生物催化應用具有重要意義。通過多學科的方法，全面揭示了假單胞菌S16中尼古丁降解的分子機制，為環境污染物的生物降解提供了新的靶點和理論基礎。
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